Cette technique d’imagerie met en œuvre des molécules qui, lorsqu’elles sont excitées grâce à une lumière de longueur d’onde donnée, reviennent à leur état fondamental en émettant de la lumière à une longueur d’onde légèrement plus élevée. Les photons lumineux émis au sein de l’animal sont ensuite détectés grâce à une caméra ultrasensible. Du fait de l’autofluorescence et de l’absorption de la lumière par les tissus, les applications in vivo se situent essentiellement dans le proche infrarouge (600-800 nm).